Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия с ними специфических AT. Для проведения РА необходимы три компонента: 1) АГ (агглютиноген); 2) AT (агглютинин); 3) раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия). В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса).

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стек­ло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1:10 - 1:20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара, переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 мин. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрица­тельной реакции жидкость остается равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках. В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 ч в термостат при 37 °С. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе «четыре плюса»: полная агглютинация - 4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+.

Реакцию агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта), сыпного тифа (реакция Вейгля).

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание (соединение) антигеннесущих корпускулярных частиц (цельные клетки, частицы латекса и др.) молекулами специфических антител в присутствии электролитов, которое заканчивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (агглютината). Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок, безжгутиковые и бескапсульные - мелкозернистый, капсульные - тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при которой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участвуют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, например эритроцитов; и непрямую, или пассивную, при которой бактериаль­ные клетки или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных, а сорбиро­ванных на них чужих антигенов (или антител) для выявления специфических к ним антител (или антигенов). В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgM. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного центра антител с детерминантом антигена, эта стадия может происходить в отсутствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей системы. Для второй стадии - образова­ния агглютината - необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комп­лексов антиген + антитело и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образовани­ем агглютината.

Реакции агглютинации ставят либо на стеклянных, либо на гладких картонных пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках. Реакции агглютинации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренного метода обнаружения специфических антител в сыворотке больного (например, при бруцеллезе) или для серологической идентификации возбудителя. В после­днем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагностические сыворотки, содержащие только монорецепторные антитела или их набор к различным антигенам. Несомненным достоинством реакции агглютинации на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько минут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концент­рированном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствительна, чем пробирочная. Развернутая реакция агглютинации в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание антител в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значе­ние. Для постановки реакции в агглютинационные пробирки вносят определенным образом разведен­ную 0,85%-ным раствором NaCl сыворотку и равный объем (обычно 0,5 мл) суспензии стандартного диагностикума (или исследуемой культуры), содержащего в 1 мл 1 млрд бактерий. Учет результатов реакции агглютинации производят предварительно через 2 ч инкубации пробирок при 37 °С и окончательно через 20-24 ч по двум признакам: наличию и величине осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости. Оценку осуществляют по четырехкрестной системе. Реакция обязательно сопровождается контролем сыворотки и антигена. В тех случаях, когда развернутую реакцию агглю­тинации в пробирке ставят для серологической идентификации возбудителя, она имеет диагностичес­кое значение, если реакция оценена как положительная при разведении диагностической сыворотки не менее половины ее титра.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных антигенов и антител не всегда наблюдаются видимые проявления реакции агглютинации. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке антигена или антител, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Оно наблюдается как при реакции агглютинации, так и при реакции преципитации. Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них антигены, как правило, являются полидетерминантными, а молекулы антител IgG имеют два активных центра. При избытке антител поверхность каждой частицы антигена покрывается молекулами антител так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подавляется также при избытке антигена, когда не остается ни одного свободного активного центра антител, и поэтому комплексы антиген + антитело + антиген не могут более укрупняться.

Варианты ускоренных реакций агглютинации. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты

Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпускулярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использо­вать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроци­ты животных или человека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, формалина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизи­рованными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они участвуют, - реакцией непрямой, или пассивной гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имеющими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагностики в этих луночках готовят двукратные разведе­ния в физиологическом растворе исследуемой сыворотки, и затем добавляют к ней в качестве диагности-кума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при 37 °С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покрывают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит в виде маленького «диска» в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных признаков наличия «диска».

РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологической диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неизвестных бактерий, вирусов, токси­нов, например возбудителей чумы, стафилококковых энтеротоксинов и др. При таком варианте поста­новки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие извест­ные по своей специфичности антитела - антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет положительна.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антиген­ным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соот­ветствующих объемах и инкубируют при 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 ч и окончательно - через 18-24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и поэтому гемагглютинация не произойдет.

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинация при добавлении антительного эрит-роцитарного диагностикума не произойдет.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной, т. е. опосредованной клет­ками-носителями антител ускоренной реакции агглютинации на стекле. В основу этой реакции поло­жено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM. При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предмет­ное стекло наносят каплю 2%-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30-60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ). Носителем антител в этой диагностической системе являются мелкие стандартные частички латекса. Реакцию выполняют микрометодом в лунках на стекле. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, сенсибилизированного антителами. Специфичность ЛАГ контролируют с помощью трех конт­рольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах: заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная реакция и контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ-несенсибилизирован-ным (не несущим антител) латексам с исследуемым материалом. В нашей стране в качестве носите­лей специфических антител используют полистироловые монодисперсные латексы с разными диамет­рами частиц (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 мкм). ЛАГ используют для быстрого обнаружения микроорганизмов или их антигенов в исследуемом материале.

Иммуномагнитное обнаружение антигенов. Один из вариантов ускоренной реакции агглюти­нации на стекле связан с применением супермагнитных полимерных частиц, покрытых специфически­ми антителами. Одна такая частица связывает до 107- 108 клеток микроорганизмов, благодаря чему чувствительность данного метода достигает 5 КОЕ/мл. Иммуномагнитное обнаружение микроорганиз­мов можно применять в комплексе с ЦПР.

Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА). Позволяет быстро обнаружить в крови больных как свободно циркулирующие антигены (антигенемия), так и антигены, связанные с антителами - циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизирован­ные соответствующими антителами. Добавление сыворотки крови больного, в которой содержатся антигены, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы антитела, приводит к склеи­ванию (агглютинации) эритроцитов и иммунных комплексов.

Антиглобулиновая проба Кумбса (реакция Р. Кумбса). При помощи реакций прямой и пассивной агглютинации определяют полные (двухвалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этими методами, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации антигена в крупные конгломераты. Неполными (блокирующими) называют антитела, у которых функционирует только один активный центр; второй активный центр по неизвестной причине не срабатывает. Для выявления неполных антител используют специальную реакцию Кумбса (рис. 72). В реакции участвуют: сыворотка больного, в которой определяют неполные антитела, корпускулярный антиген-диагностикум, антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к человеческому глобулину. Реакция протекает в два этапа:

Взаимодействие антигена с неполными антителами. Видимых проявлений при этом нет. Первый этап заканчивают отмывкой антигена от остатков сыворотки больного.

Взаимодействие антиглобулиновой сыворотки, полученной в результате иммунизации животного человеческим глобулином, с неполными антителами, адсорбированными на антигене. В силу того, что антиглобулиновые антитела двухвалентны, они связывают два одновалентных антитела отдельных комплексов АГ + неполное антитело, что приводит к их склеиванию и появлению видимого осадка.

Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

ПЛАН:

Виды иммунных реакций.

Условия проведения серологических реакций.

Требования к сыворотке.

Понятие положительный и отрицательный результат.

ОНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

Виды иммунных реакций.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig)

in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

Серологические реакции: 1) определение, 2) фазы, 3) цели постановки, 4) общая классификация.

1) Определение

Серологические методы исследования (от лат. Serum - сыворотка и logos - учение) с помощью реакции антиген-антитело.

2) Фазы

2 фазы взаимодействия:

I. Специфическая (видимая) – наступает быстро, aнтитела соединяются с соответствующими им антигенами. В эту фазу взаимодействуют детерминантные группы антигенов (АГ) и активных центров антител (АТ).

В образовании комплекса АГ+ АТ участвуют силы:

Кулона;

Ван дер Ваальса

Водородные связи.

Никаких видимых изменений в этой фазе нет. При электронной микроскопии комплекс АГ+АТ в виде решетки.

II. Неспецифическая – наступает медленно, образовавшийся комплекс антиген – антитело реагирует с дополнительным неспецифическим фактором среды, в которых происходит реакция, и это видимо глазом – склеивание, растворение, выпадение хлопьев осадка и т. п. В присутствии электролита снижается заряд, уменьшается растворимость, образуются видимые конгломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

3) Цели постановки :

а) для идентификации антигена (антитело известно-диагностическая сыворотка):

• в патологическом материале (экспресс-диагностика);

  в чистой культуре:

  1. серологическая идентификация (определение вида);

     серотипирование (определение серовара) – определение штамма;

б) для выявления антител (Ig) (антиген известен-диагностикум):

• наличия (качественные реакции);

  количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

4) Общая классификация серологических реакций :

а) простые (2-х компонентные: Ag+Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag+Ig+C);

в) с использованием метки.

Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

Реакция агглютинации (РА) - иммунная реакция взаимодействия суспензии АГ (эритроцитов, бактерий) с АТ в физиологическом растворе.

При агглютинации происходит склеивание частиц АТ с образованием хлопьевидного осадка.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, в которой используют антительный или антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности АТ или АГ).

Эритроциты в этой реакции выполняют роль пассивных носителей.

Оценка результатов РПГА проводится следующим образом:

- при положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно U- или V-образной лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»);

- при отрицательной реакции (отсутствии агглютинации) эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют при диагностике вирусных инфекций. Некоторые вирусы содержат на своей поверхности белок гемагглютинин, склеивающий эритроциты. Добавление специфических противовирусных АТ блокирует вирусный гемагглютинин - гемагглютинация отсутствует.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакцию Кумбса, применяют для определения неполных АТ. Добавление антиглобулиновой сыворотки (АТ против Ig человека) усиливает результаты реакции. РНГА применяют при определении резус-фактора.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1) антиген (агглютиноген) АГ;

2) антитело (агглютинин) АТ;

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул-тел (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

РА используют для:

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены).

Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации).

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки ( известные АТ ).

Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Компоненты:

1. стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки (АТ);

2. исследуемая чистая культура от пациента;

3. физ.раствор.

В исследуемой чистой культуре антигены (АГ) в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Пример:

Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят каплями:

1 дизентерии ;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа ;

(1-2 диагностические сыворотки)
3 -я капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа (определялись антигены).

Для определения АТ в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум , содержащий взвесь известных микробов или их антигенов АГ .

Определение групп крови системы АВО (реакция гемагглютинации (РГА)) – агглютинируют эритроциты.

Компоненты реакции:

1. АГ (эритроциты крови) исследуемая кровь

2. АТ (эритротесты- цоликлоны)

Набор цоликлонов:

Реагент Цоликлон анти-А (розовый)

Реагент Цоликлон анти-В (синий)

Реагент Цоликлон анти-АВ (бесцветный)

3. электролит (физиологический раствор)

Техника определения:

1 .

В лунки планшета наносится по одной капле (0,1 мл) цоликлона анти - А, анти - В и анти – АВ (для контроля).

2.

Рядом с каждой каплей реагента наносится маленькую (0,05-0,01 мл) каплю исследуемой крови.

Затем капля цоликлона смешивается с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой.

3.

Реакция агглютинации развивается в течение первых 3-5 секунд при мягком покачивании пластинки.

Результаты реакции учитываются через 2,5 - 3 минуты после смешивания капель. Слева направо в лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.

Положительный результат-появление зернистого осадка (агглютината).

положительная РА (+)

Отрицательный - осадка нет.

отрицательная РА(-)

4.

Анализ результатов.

O (I ) α β – агглютинации нет

A (II ) β – агглютинация с анти-А

B (III ) α – агглютинация с анти-В

AB (IV )О – агглютинация с анти-А, с анти-В

Схематичное изображение агглютинации.

Антигены АГ на эритроцитах (определяемые) + антитело АТ (цоликлон) диагностическая сыворотка

Учет агглютинации в планшетах

Реакция преципитации:

Реакция преципитации - иммунная реакция взаимодействия АГ в растворимом состоянии с АТ в физиологическом растворе.

При преципитации происходит образование макромолекулярного иммунного комплекса, что проявляется переходом прозрачного коллоидного раствора в непрозрачную суспензию, или преципитат.

Количество обоих реагентов должно быть в строго определенных соотношениях, так как избыток одного из них снижает результат.

Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

1. Реакцию кольцепреципитации ставят в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый АГ. АГ и АТ смешиваются за счет теплового движения молекул, и они взаимодействуют. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо непрозрачного преципитата.

2. Реакцию двойной иммунодиффузии по Оухтерлони проводят в агаровом геле, в лунки которого вносят по схеме либо раствор АГ, либо раствор АТ. АГ и АТ диффундируют в гель навстречу друг другу и при положительном результате реакции образуют иммунные комплексы, видимые как линии преципитации.

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты РА:

преципитирующая сыворотка (известное АТ-преципитин);

исследуемая сыворотка (неизвестный АГ-преципитиноген);

физ. Раствор.

Реакцию преципитации ставят в или в специальных узких пробирках (реакция кольцепреципитации), или в чашках Петри в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцеприципитации

Постановка и учет результатов реакции кольцепреципитации для обнаружения возбудителя сибирской язвы (Асколи реакция).

Постановка .

1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ растворе5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта). Фильтруют.

2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку.

3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт).

Учет .

В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична

С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Реакция преципитации в агаре

Постановка и учет результатов реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии)

Постановка

Ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри.

1. Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой .

2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры .

В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная , должна быть заведомо токсигенной .

Посевы помещают в термостат.

Учет

Анализ проводят через 24-48-72 ч.

Положительный результат - (культура токсигенная) - на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата , « стрелы-усики », которые хорошо видны в проходящем свете.

На рисунке представлена реакция преципитации в агаре на определение токсигенности дифтерийных палочек. Средние культуры не образовали «стрел-усиков», это не токсикогенные возбудители.

Штаммы возбудителя дифтерии могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.

При заболевании все возбудители дифтерии тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре

Сложные серологические реакции ( 3–х компонентные:Aг+Ig+C):

Реакция связывания комплемента (РСК).

Реакцию проводят в два этапа.

На первом этапе АТ взаимодействуют с АГ и комплементом, на втором этапе добавляют индикатор - гемолитическую систему (смесь эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки).

При положительном результате на первом этапе АТ образуют с АГ иммунный комплекс, связывающий комплемент реакционной смеси.

В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на втором этапе, не разрушаются.

В противном случае несвязанный комплемент вызывает лизис индикаторных эритроцитов.

Для ее проведения необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система) (рис.1).

Реакция протекает в две фазы (рис. 3).

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает (рис).

Результат опыта оценивают (рис.2), отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь).

Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 4. Постановка и результат РСК.

Вывод: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса.

Диагностическое значение имеет:

четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) ;

двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Реакции с использованием метки :

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлуоресценции основана на световой индикации комплекса антиген-антитело

Иммуноферментный анализ.

Современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;

2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);

3) исследование гормонального статуса пациента;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

На рисунке твердофазный ИФА – известные АГ (слева) адсорбировн а на лунке планшета, (справа) на лунках планшета известные АТ

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя., конъюгированных с ферментом-меткой.

Постановка ИФА (общий механизм):

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Компоненты реакции:

1. АГ(АТ) известное – на лунке планшета.

2. АТ (АГ) исследуемое.

3. АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)

4.хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент

5. стоп раствор

Основные этапы проведения ИФА

1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Образуется комплекс.

2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ первого этапа. Фермент активизируется.

3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный цвет раствора.

4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.

Учет.

Положительный результат- изменение цвета, на рисунке – желтый цвет.

Иммунохроматографический анализ

Метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых».

К преимуществам ИХА следует отнести:

Быстроту и легкость в использовании;

Малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

Дешевизну для производителя и потребителя;

Возможность производства тестов в больших объемах;

Простоту чтения и интерпретации результата;

Высокую чувствительность и вопроизводимость;

Возможность количественного определения;

Возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

Возможность мультианализа.

Компоненты (нанесены на тест-полоску):

1. Конъюгат с меткой коллоидного золота – специфичен к определяемому АГ.

2. АТ тестовой линии – специфичны к комплексу АТ-АГ

3. АТ контрольной линии – специфичны к конъюгату.

Постановка ИХА:

1.Нанесение образца на обозначенный стартовый участок полоски.

2. Получение результата в виде появления окрашенных полос на месте тестовой и контрольной линии.

Учет

Положительный – при окрашивании тестовой линии.

Отрицательный - при отсутствии окрашивания тестовой линии.

Недостоверный – при отсутствии окрашивания контрольной линии.

Общий механизм ИХА:

1. Образец вносится на стартовое поле (подушку образца) и связывается с конъюгатом (специфичное тело с цветной меткой), которые находятся на подушке конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс.

2. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с АТ тестовой линии. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоса.

3. Не связавшиеся на тестируемой полосе АТ (конъюгат) движется дальше и достигает контрольной линии, связывается с АТ контрольной линии. В результате появляется вторая окрашенная полоса. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.

2. Условия проведения серологических реакций.

1. Наличие гомологичных – соответствующих друг другу антигена и антитела.

2. Чистая, сухая посуда.

3. Определенное соотношение препаратов (чаще всего равное).

4. Обязательное присутствие электролита (изотонический раствор NaCl).

5. рН нейтральный или близкий к слабощелочному.

6. Температура +37°С или комнатная (обязательно плюсовая).

7. Проводится контроль антигена и контроль сыворотки (антител).

3 Требования к сыворотке

Сыворотка должна быть совершенно прозрачная без примеси клеток

Получают на 2 неделе болезни обычно, когда уже есть в наличии антитела.

Кровь берут в количестве 3-5 мл натощак или через 6 ч. после еды.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре или центрифугируют. Отсасывают сыворотку очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определённой схеме соответствующим антигеном (вакциной). Готовят сыворотки обычно на производстве.

4. Понятие положительный и отрицательный результат.

РА.

При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями (см. рисунки выше).

РП.

При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета (см. рисунки выше).

ИФА.

Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

РСК.

Задержка гемолиза - реакция положительна; если комплемент свободен, наблюдается гемолиз - реакция отрицательна (см. рисунки выше).

Результаты реакции Вассермана:

а - полная задержка гемолиза (+ + ++);

б - выраженная задержка гемолиза (+ ++);

в - частичная задержка гемолиза (++);

г - слабая задержка гемолиза (+);

д - полный гемолиз (-).

Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Домашнее задание:

1. Изучите материал

Составьте 3 конспекта по видео

ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы применяют для решения многих задач:

1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.

2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.

3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.

4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.

5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).

6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:

1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;

2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.

Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов

· агглютинации,

· преципитации,

· лизиса.

Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакцию Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром - максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.

Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:

1) для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),

2) для серодиагностики - определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 - 6 ч для ускорения свертывания, затем - в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.

Адсорбированныесыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.

Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы :

1) основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

2) основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

3) с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

№ 29 Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.
Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:
1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя , выделенного от больного;
3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.
Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что
затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены
перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела,
специфичные только к данной бактерии.

Агглютинации реакция Агглютинации реакция

(РА) - способ выявления и количественного определения Аг и Ат, основанный на их способности к образованию видимых невооруженным глазом агломератов. В д-ке инфекц. болезней или в др. целях применяется для идентификации неизвестных микробов и клеток, для определения присутствия и количества Ат в с-ке крови и др. жидкостях. Принцип определения основан на специфичности взаимодействия Аг и Ат и состоит в нахождении известного по неизвестному. Существует много вариантов РА: количественные и качественные, пробирочные и на стекле, объемные и капельные, обычные, ускоренные и экспресс-методы. Для постановки РА необходимы: 1) с-ка крови. В варианте с определением вида (вара) бактерий используют производственные агглютинирующие с-ки, изготовляемые путем иммунизации кроликов. В варианте с определением вида Ат берут с-ку крови, получаемую от иссл. людей или животных. С-ка должна быть стерильной и не содержать взвешенных частиц. Готовят основное разведение на физ-растворе. Оно должно быть в 2 -4 раза ниже диагностического титра при данном заболевании; 2) Аг . В варианте реакции с определением типа Ат используют производственные диагностикумы; в варианте с определением Аг диагностикумы готовят сами в виде 1 -3-миллиардной взвеси на физрастворе 18-20-часовой агаровой (реже бульонной) к-ры иссл. микроба, инактивированной прогреванием на водяной бане при 70°С в течение 1 ч или 24-часовой инкубацией при 37°С с формалином (конечная концентрация 0,2%); 3) электролит в виде физраствора. Техника постановки объемной серийной пробирочной РА для определения титра Ат в с-ке: из основного разведения с-ки готовят несколько рядов рабочих разведении. Число рядов зависит от количества взятых в опыт диагностикумов, число и факторы разведения определяются диагностическим титром предполагаемого заболевания. В ряду по меньшей мере должны быть разведение, соответствующее диагностическому титру Ат, два разведения ниже и два разведения выше его. напр., если диагностический титр равен 1:100, то при объемном способе постановки РА должны быть приготовлены следующие разведения с-ки: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; при капельном методе первое разведение (1:25) не нужно, зато необходимо еще одно более высокое разведение - 1:800. В научных исследованиях с-ку титруют до отрицательной реакции. Разводят ее следующим образом: во все опытные пробирки, кроме 1-й, наливают по 0,25 мл физраствора при постановке реакции в объеме 0,5 мл и по 0,5 мл при постановке реакции в объеме 1 мл. В 1-ю и 2-ю пробирки вливают по 0,25 (0,5) мл основного разведения с-ки, из 2-й пробирки, в к-рой объем и разведение с-ки увеличились в 2 раза, 0,25 (0,5) мл переносят в 3-ю, из 3-й в 4-ю и т.д. до последней, из к-рой 0,25 (0,5) мл для уравновешивания объемов выливают во все. Каждое разведение с-ки осуществляют с помощью отдельной пипетки. Если в опыт берут несколько диагностикумов, то для каждого из них готовят таким же способом свой ряд разведении. В каждое разведение с-ки доливают диагностикум в объеме, равном объему с-ки, в результате чего разведение в каждой пробирке увеличивается в 2 раза. Опыту соответствуют контроль с-ки (0,25 -0,5 мл основного разведения с-ки и столько же физраствора) и контроль Аг (0,25 - 0,5 мл диагностикума и столько же физраствора). Если в опыт берут несколько диагностикумов, то каждому соответствует свой контроль Аг. Штатив с пробирками хорошо встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 4 ч, а затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня, после чего проводят учет РА, основываясь на количестве осадка и степени просветления жидкости. Определение этих показателей в зависимости от характера агглютинатов осуществляют невооруженным глазом на темном фоне, в агглютиноскопе или над вогнутой поверхностью зеркала от микроскопа. Учет начинают с контролей: контроль с-ки должен быть прозрачным, Аг - равномерно мутным (после встряхивания пробирки). Если контроли хорошие, устанавливают наличие и степень агглютинации во всех опытных пробирках, к-рую обозначают плюсами: большой осадок и полное просветление жидкости - 4 плюса; большой осадок и неполное просветление жидкости -3 плюса; заметный осадок и заметное просветление жидкости- 2 плюса. После этого определяют титр: наибольшее разведение с агглютинацией интенсивностью не менее 2 плюсов. Титр иссл. с-ки сравнивают с диагностическим титром для этого заболевания. Если титр иссл. с-ки в 2 раза ниже диагностического, реакцию оценивают как сомнительную; если титр равен диагностическому -как слабоположительную; если в 2-4 раза выше его- как положительную, если в 8 и более раз выше - как резко положительную. При широком распространении Ат у здоровых людей для оценки РА применяют нарастание титра Ат. Для определения вида Аг в серийной РА число рядов должно соответствовать числу взятых для идентификации диагностических с-к. Из основного разведения диагностической с-ки готовят ряд последовательных двукратных разведении таким же способом, как и в РА для определения титра Ат. Факторы разведении зависят от титра агглютинирующей с-ки В опыте необходимо присутствие разведения, равного титру с-ки, а также в 2, 4, 6, 8 раз ниже его напр., если титр диагностической с-ки равен 1 3200, то следует использовать разведения 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 К разведениям с-ки доливают такой же объем иссл Аг, в результате разведение с-к увеличивается в 2 раза К опыту ставят 2 контроля с-ки и Аг Если в опыте участвует несколько с-к, то к каждой из них нужен свой контроль По завершении реакции штатив энергично встряхивают и помещают в термостат при 37°С Результаты учитывают, как описано выше Оценка реакции имеет особенности Для того чтобы сделать вывод о соответствии иссл. Аг взятой в опыт с-ке, титр реакции должен соответствовать не менее половине титра стандартной диагностической с-ки Титры в 1 4 и ниже рассматривают как групповую реакцию Капельный м д постановки РА отличается от объемного тем, что с-ку разводят в объеме 1 мл, Аг применяют в более высокой концентрации (10 млрд/мл) и добавляют его по 1 - 2 капли в пробирку Разведение с-ки после внесения Аг считают неизмененным В остальном методика постановки, учета и оценки аналогична объемному методу

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)